Laboratoire Gly-CRRET :

Croissance, Réparation et Régénération Tissulaires

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Imagerie en Microscopie

Plusieurs systèmes d’acquisition d’image sont accessible au laboratoire, aussi bien pour des sujets macroscopiques que microscopiques.

Les préparations histologiques révélées par coloration histochimique, ou par immuno-marquage, sont observables au microscope depuis l’imagerie couleur standard sur microscope droit jusqu’à l’observation en epifluorescence ou fluorescence confocale sur microscope inversé, que ce soit sur lame de verre ou en boite de pétri à fond mince.


Microscopie Confocale à Disque Rotatif


La plateforme propose un microscope inversé Olympus IX 81 à épifluorescence muni d’un système confocale à spinning disc (DSU) à lumière incohérente (arc metal halide). L’acquisition se fait par l’intermédiaire d’une caméra CCD refroidie Hamamatsu Orca R2. Cet outil d’une grande simplicité d’utilisation, permet des observations confocales ou non du même champs, à la même résolution, et ce sur 5 canaux (contraste de phase, fluorescences bleue, verte, rouge, et proche infra-rouge).


  • Les bandes passantes sont données avec précision sur les liens suivants :
    dsu-bis-2
    - Excitation UV, fluorescence bleue (U-MNU2 ).
    - Excitation bleue, fluorescence verte ( U-MWIBA3 ).
    - Excitation verte, fluorescence rouge (U-MNG2 ).
    - Excitation rouge, fluorescence proche IR (CY5 ).
  • Ce système est utilisable avec les objectifs suivants  :

    - 4x phL NA 0.13 UplanFLU
    - 10 x ph1 NA 0.3 UPlanFLN
    - 20 x ph1 NA 0.45 LUCPlanFLN
    - 40 x ph2 NA 0.6 LUCPlanFLN
    - 60 x ph3 NA 1.25 Oil UplanFLN
    - 40 x NA 1.3 Oil UplanFLN

Cet appareil procure des images grandement déflouées en plan simple, et avec des piles axiale il autorise après déconvolution, des analyses et rendus 3D pour des structures dont la taille est au minimum de l’ordre du micron.

- Exemple d’application : Antitumor and angiostatic activities of the antimicrobial peptide dermaseptin B2. van Zoggel H, Carpentier G, Dos Santos C, Hamma-Kourbali Y, Courty J, Amiche M, Delbé J. PLoS One. 2012 (Résumé).


Observation de Cellules Vivantes


Le système décrit ci-dessus peut être utilisé pour l’observation de cellules vivantes à l’aide d’une chambre thermostatée disposée sur la platine porte objet. Les cellules y sont maintenues à hygrométrie constante à une température de 37°C sous une atmosphère à 5 % de C02. spacer livin-glob-amb-2 chamberLiving-amb-4 spacer


Microscopie Confocale à Balayage Laser


Le laboratoire s’est équipé récemment d’un système de microscopie confocale à balayage laser (acquisition point par point) Olympus FV1000.

fv1000pano-amb-bis

Ce système permet d’observer 5 canaux en fluorescence bleu, rouge, verte, infra rouge, ainsi que la transmission.

  • L’excitation est assurée par quatre lasers :
    fv1000-amb-bis-2
    - Diode laser proche UV (405 nm) pour la fluorescence bleu (430-455 nm).
    - Diode laser bleu (473 nm) pour la fluorescence verte (490-525 nm).
    - Laser à gaz HeNe vert (543 nm) pour la fluorescence rouge (560-620 nm).
    - Diode laser rouge (635 nm) pour la fluorescence proche infra rouge (655-755 nm).
  • Ce système est utilisable avec les objectifs suivants :

    - 60 x NA 1.35 Oil UplanSApo
    - 40 x NA 1.3 Oil UplanFLN

Ce système permet d’obtenir une résolution utile de l’ordre de 50 nm par point, utilisé avec un objectif à immersion à huile 40 x (NA 1.3) et de l’ordre de 25 nm par point avec l’objectif 60 x.


Microscopie de Routine


Pour les applications routinières de contrôle ou d’observation, deux autres microscopes sont disponibles :


- Microscope automatique Evos. Ce microscope sans oculaire permet les observations en couleur et en fluorescence, ainsi que l’acquisition de « scans » de lames par de acquisitions de mosaïques d’images. Les objectifs disponibles sont 4x, 10x, 20x et 40x, les fluorescences, en rouge, vert et bleu, permettent typiquement l’observation du DAPI, des GFP et RFP.

- Microscope droit à épifluorescence Olympus BH2 muni d’une caméra CCD monochrome Scion et des objectifs 10x, 20x, 40x et 100x (ces deux derniers à immersion à huile). Les fluorescences classiques rouge, verte bleue, ainsi que le contraste de phase sont disponibles (typiquement pour les observation de DAPI, FITC, rhodamine etc...).

spacer Evos2 bh2-1-2



Acquisitions d’Images Semi-microscopiques et Macroscopiques


Pour prendre des images semi-microscopiques (larges coupes histologiques, biopsies etc...), un mini microscope Dino Lite muni d’un filtre polarisant permet d’avoir un champs large sans reflets. Enfin pour tout ce qui est images de gel d’acrylamide, d’agarose ou de colonies bactériennes par exemple, une camera vidéo CCD Panasonic monochrome BL-200 couplée à une carte d’acquistion Scion LG3 permet d’acquérir des images de qualité compatible avec une analyse densitométrique.

spacer dino lg7


spacer Développement d’Outils Informatiques avec le Logiciel ImageJ

spacer imagej-1

Des outils logiciels originaux sont développés depuis plusieurs années au laboratoire par Gilles Carpentier. Ces outils sont conçus pour répondre à des problèmes particuliers rencontrés par les chercheurs du laboratoires, et sont pour nombre d’entre eux, mis à la disposition de la communauté sur le site du NIH de ImageJ, ou bien sur le site de l’auteur.

Parmis les sujets abordés, on peut citer les analyses de dot blot, de protein array, l’analyse quantitative in vitro et in vivo de l’angiogenèse, l’analyse des chambres de Boyden, la calibration spaciale des images ou l’aide à l’édition d’images multidimentionnelles etc...

- Liens associés : image.bio.methods.free.fr, ImageJ on Wikipedia, ImageJ software

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Responsable, Gilles Carpentier. Contact : carpentier@u-pec.fr